宝“剪”锋从磨砺出！CRISPR的问世确实带来了基因编辑的黄金时代，编辑人类胚胎、闯入临床研究、“霸屏”CNS，每一项都足以振奋人心。而2017年CRISPR似乎更具魔力，它以前所未有的精度，可对各种生物体的DNA做出微调。如今，年终盘点季，带领大家一起回顾一下“魔剪”CRISPR技术在过去一年的“丰功伟绩”。

CRISPR的新玩法——微调DNA

1.不切DNA，照样也能治疾病

美国沙克生物研究所的研究者开发出一种新型CRISPR-Cas9系统，能在不切开DNA的前提下，对基因进行激活。他们将Cas9酶表达基因插入一个腺相关病毒（AAVs）的同时，利用另一个AAV引入短sgRNA和转录激活剂。sgRNA只有14或15个核苷酸，可阻止Cas9切割DNA，并促使其与转录激活剂协同作用。

值得一提的是，该系统在多种疾病小鼠模型中实现了“疾病逆转”，如急性肾脏疾病小鼠模型、1型糖尿病小鼠模型和肌肉萎缩症小鼠模型。这也证实了新CRISPR技术是安全的，不会产生不想要的基因突变。

参考文献：In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation (DOI:10.1016/j.cell.2017.10.025)

2.自由替换DNA碱基，精准打靶

2016年，哈佛研究者成功利用CRISPR技术将DNA的C转化为U，即实现了C•G碱基对向T•A碱基对的转换。而今年同一个研究团队再次开发出了“新碱基编辑器”ABE（Adenine Base Editor）实现了C•G向T•A的转换。

简单来说，就是一种改造后的TadA酶，将靶DNA链中的腺嘌呤（A）转换为肌苷（I，I可起到类似鸟嘌呤G的作用），然后“诱骗”细胞修复另一条DNA链以完成碱基对的转换。研究者利用该技术成功逆转了与遗传学血色病相关的G-to-A突变。

参考文献：Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage (DOI: 10.1038/nature24644)

3.设置“关闭开关”，更好驾驭CRISPR

为了避免CRISPR误伤友军，Doudna教授团队则通过两种anti-CRISPR蛋白（ACR）——AcrIIC1 和AcrIIC3，以不同的策略来抑制Cas9酶。前者可直接结合到Cas9酶保守的HNH催化域来阻止多种不同Cas9同源DNA切割；后者通过诱导了Cas9的二聚化来阻止Cas9绑定靶向DNA。

另外，他们还发现升级版Cas9蛋白（如eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1）之所以能实现更精准的DNA切割，是因为其负责感知靶向结合准确性的REC3域发生了突变，使得它们结合非靶目标时，更不容易激活它的“剪刀作用”。

参考文献：A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9 (DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.037)

挖掘新技能，CRISPR“瞄上了”RNA

既然CRISPR已将DNA纳入囊中，又怎会放过DNA的“近邻”RNA呢。近期，CRISPR家族就已经磨刀霍霍向RNA了。

1.抢RNAi饭碗，编辑RNA

张锋研究团队测试了来自15种不同微生物的Cas13a（C2c2酶），最终发现LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具（RNAi）更强的特异性在靶RNA上切割特定位点，脱靶效应低。另外，他们还找到了Cas13的“死亡变体”，即能结合RNA，却不能进行切割作用。且该版本的Cas13可通过结合荧光标记来追踪RNA的轨迹。

参考文献：RNA targeting with CRISPR–Cas13 (DOI:10.1038/nature24049)

2.筛选lncRNA，CRISPR更方便

研究者研发一种基因组规模的CRISPR-Cas9激活筛选，能够靶向超过10000 lncRNA转录起始点，以识别影响表型的非编码位点。结果发现有11个lncRNA位点，通过招募激活剂在人类黑色刘细胞中调节对BRAF抑制剂的耐药性；且大多数候选位点均可调节附近的基因。

因而研究可以通过这一筛选工具，系统性的发现非编码吗位点的功能，并阐明它们在基因调控和细胞功能中的多种作用。

参考文献：Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood (DOI:10.1038/nature24009)

3.首次证实circRNA与大脑息息相关

Cdr1as是哺乳动物大脑中高表达的一种环状RNA，因其从DNA反义链转录而来，没有良好表达的线性等价物，导致其相关功能的分析缺失。

研究者在发现Cdr1as可以和miR-7、miR-671均结合后，则利用CRISPR-Cas9选择性删除了小鼠中的Cdr1as基因，结果发现miR-7的水平下调了，miR-671的水平上调了。而且Cdr1as敲除小鼠中与大脑活性相关的“即刻早期基因”（如Fos，且很多为miR-7靶标）的表达发生了变化，而小鼠也表现除了异常的神经元活动。

参考文献：Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function (DOI:10.1126/science.aam8526)