【中英文题目】
小麦抗赤霉病基因Fhb1基因，编码带有凝集素结构域以及类毒素成孔结构域的嵌合凝集素
Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight
【基本信息】
期刊：NATURE GENETICS
年份：2016
IF: 32.197
【摘要】
小麦赤霉病(FHB)是由镰刀菌引起的，对麦类作物的破坏性极强，造成粮食严重减产，食用患病小麦的人畜会产生不良反应。随着FHB在美国、加拿大、欧亚以及南非的相继爆发，FHB已经成为全球关注的话题。在1993-2001年的美国，由于FHB造成的经济损失大约70.67亿美元。大量研究表明，Fhb1基因是抗FHB的数量性状位点(QTL)，文章报道了关于中国小麦栽培种Fhb1基因的图位克隆技术。通过进行变异分析、基因沉默以及转基因表达，发现Fhb1基因含有类毒素成孔结构域(PFT)，具有抗赤霉病的作用，推测PFT编码含有两个凝集素结构域和一个ETX/MTX2毒素结构域的嵌合凝集素。
【研究思路】
取材：
取抗性和易感近同源系(R-NIL 260-1-1-2和S-NIL 260-1-1-4)用于本次基因表达研究
取Kansas State University的41个地方种和栽培种的种子用于本次研究关联分析
文库构建及测序策略：
基于Sumai 3（苏麦3号，含有Fhb1基因位点的中国栽培种）构建BAC库，基因覆盖度~3×，插入序列的平均长度~100 kb
信息分析：
【研究结果】
1、对抗FHB的基因的进一步确定
Fhb1基因来自中国栽培种Sumai 3，是重要的QTL位点，文章报道了Fhb1基因的定位克隆，之前已经有研究将Fhb1基因的范围缩小到0.08cM，两侧的DNA标记分别为STS3B-355和STS3B-334，本研究利用了同样的标记物，其他标记物来自CS（普通小麦中国春） 3BS，根据BAC末端标记筛选Sumai 3 BAC文库。
文章通过指纹法组装了8个重叠的BACs，并对4个BACs(476D8, 71I24, 383G12以及572D13)进行测序，在Fhb1附近形成两个contigs(一共~350 kb)，之后进一步组装注释。如图1，对Sumai 3的13个基因进行了注释。将Sumai 3的Fhb1区域与CS的3B和3D染色体的同源区域进行比较，发现Sumai 3的Fhb1区域在基因成分和长度上与3D染色体更为相似。
图1 Fhb1对应表型以及map过程 (a)抗性和易感的近同源系(NILs)的穗表现出不同的FHB表型。相比R-NIL（抗性）的穗，S-NIL（易感）的穗发生严重褪色；(b) S-NIL的被镰刀霉损坏的干瘪的谷粒与R-NIL饱满健康的谷粒的比较；(c) Sumai 3中Fhb1基因在染色体上的定位；(d)染色体上经3B 355和3B 334标记的0.08cm区间展现出Fhb1基因的染色体图谱；(e) Sumai 3中Fhb1基因的物理图谱，包括13个开放读码框（箭头表示）及其对应位置。橙色线条表示不含基因的重复区域，将编码蛋白的基因分别进行标记：MT表示tRNA甲基化转移酶；PG表示果胶酶；NAD表示结合NAD的氧化转移酶；NBA含有Nb-ARC结构域；TS表示类合成酶；His表示富含组氨酸的钙结合蛋白；HC表示类HCBT的防御应答蛋白；PFT表示成孔类毒素；Sin表示sina超家族；SG表示SGNH植物酶；Cys表示胱抑素；FB含有F-box结构域；带星号的基因排除在Fhb1候选基因以外。(f)与CS 3DS的同源区域的比较；(g) 与CS 3BS的同源区域的比较。‘ζ’和‘ψ’分别表示基因片段和假基因；ψUDG表示假基因UDP-葡萄糖 6-脱氢酶。
为了确定抗FHB的基因，文章利用实时定量PCR对麦穗中的注释基因进行表达分析，对于抗性近等位基因系(R-NIL)和易感近等位基因系(S-NIL)分别注入镰刀霉和水。PFT基因和含Nb-ARC结构域的基因(NBA)只在R-NIL中表达，而其他基因在两种NIL中均表达。此外，通过基因互补，将13个基因中的6个排除在外（图1e），剩下的7个基因中，PFT基因和NBA基因是已知的在植物抗性中可能发挥主要作用的基因，因此，文章针对这两个候选基因做了进一步的基因结构和蛋白质序列的预测。
2、PFT基因的结构及突变分析
PFT基因全长3472bp，含有两个外显子，最终产生1437bp的mRNA，cDNA末端(RACE)的随机扩增表明PFT转录本含有一个49bp的5’UTR区和216bp的3’UTR区（图2a）；预测蛋白含有478个氨基酸，并包含了两个凝集素结构域和一个ETX/MTX2结构域（图2b）；此外，文章中利用针对诱导基因组局部病变(TILLING)的方法来确定PFT的候选基因。从1929个M2家系中筛选出30个突变体，突变体pft1284, pft1958, pft1409, pft1700以及 pft528在纯合子状态下致使作物易感FHB（图2a），另外，图2c可以看到，易感突变体在被感染后麦穗发生严重脱色，但是，HR58亲本的麦穗则是健康的。除此之外，这些突变体还含有很高的脱氧雪腐镰孢烯醇(DOH)，麦穗也表现出很高比例的枯萎褪色，麦粒干瘪缺水（图2d）；
图2 PFT的基因结构和突变分析 (a)PFT基因含有两个外显子（橙色框）通过一个内含子（黑色线条）相连，两头的绿色框表示的是非编码区，箭头表示易感TILLING突变；(b)PFT蛋白保守结构域的分析显示含有两个凝集素超家族结构域和一个ETX/MTX2超家族结构域，灰色框利用数字标志了氨基酸的位置；(c)易感的TILLING突变突变体被FHB感染后表现出严重的褪色现象，白色箭头指向的是接种位点；(d)突变体的镰刀霉感染的谷粒与健康的抗性HR58亲本的谷粒的比较。
3、RNAi诱导基因沉默来验证PFT基因的功能
RNAi可以诱导基因沉默，文章对小麦栽培种Bobwhite中的PFT基因做RNA干扰，该品种适合进行转化但是不含有Fhb1（图3a），而含有Fhb1的Sumai 3和R-NIL则不适用于组织培养，因此不适合进行转化。图3b可以看到，R-NIL和Bobwhite（未转化）杂交得到的F1代植株可以抗FHB病；定量PCR结果表明，PFT的表达在R-NIL-RNAi F1代植株的麦穗中的表达比R-NIL-Bobwhite植株至少减少150倍（图3e），Fhb1抗性株往往携带有PFT基因。
图3 RNAi诱导基因沉默来验证PFT基因的功能 (a)用于转化实验的PTF基因经过自补RNAi构建的结构示意图；(b)经RNAi诱导以及镰刀霉交叉感染的发白的麦穗与未进行RNAi的绿色的麦穗的比较示意图，F1 R-NIL与RNAi Bobwhite杂交后麦穗严重褪色，易感Bobwhite和RNAi Bobwhite杂交结果也是如此，但是R-NIL与未进行RNAi的亲本杂交得到的却是绿色的麦穗（中间），图中黑色的点就是感染位点；(c) 经RNAi诱导以及镰刀霉交叉感染的发白的麦粒与未进行RNAi的绿色的麦粒的比较示意图，F1 R-NIL与RNAi Bobwhite杂交后麦粒干瘪发白，但是R-NIL与未进行RNAi的亲本杂交得到的却是健康的种子；(d)反转录PCR发现只在转基因系中进行RNAi（第一个胶）；PFT基因在非转基因对照组中表达，但是在RNAi系中表达受到抑制（第二个胶）；肌动蛋白则证明mRNA在所有样本中均有表达（最后一个胶）；(e)对F1植株开花前期的麦穗做定量PCR发现相比未进行RNAi的样本，进行RNAi的样本至少减少了150倍。
【研究结论】
文章通过进行变异分析、基因沉默以及转基因表达，发现Fhb1基因含有类毒素成孔结构域(PFT)，具有抗赤霉病的作用，推测PFT编码含有两个凝集素结构域和一个ETX/MTX2毒素结构域的嵌合凝集素。
Fhb1的序列信息有利于在标记辅助育种中涉及更好的标记物，为FHB疾病多基因聚合和基因工程提供长远经济的解决思路。