RNA sequencing and functional analysis implicate the regulatory role of long non-coding RNAs in tomato fruit ripening
RNA测序和功能分析长链非编码RNA在番茄果实成熟过程中的调控作用
Journal of Experimental Botany， IF= 6.5，2015.05
摘要：近年来，长链非编码RNA (lncRNAs)在模式植物拟南芥，水稻，玉米中起着重要的调控角色。 然而， lncRNAs 的存在以及如何在成熟果果肉中发挥作用仍然不清楚，因为果实成熟还没有在模式植物中呈现。番茄由于其显著的成熟过程可作为模式系统来研究果实的成熟， 为了进一步研究lncRNAs 在果实成熟中的作用，急需发现和鉴定出新的lncRNAs在番茄果实成熟过程中的作用 。此研究在野生番茄和成熟突变果实中发现 3679 个lncRNAs ， lncRNAs 由所有的番茄染色体转录而来, 85.1% 来自基因间区。 番茄lncRNAs 外显子数目和长度均低于mRNA，在成熟突变体果实中有490个lncRNAs 显著上调，187个 lncRNAs 下调，表明 lncRNAs 能调控果实成熟的调控。与此结果一致，沉默两个新的番茄基因间区lncRNA1459和 lncRNA1840之后，明显延缓了番茄果实的成熟。总之，结果表明lncRNAs在番茄果实成熟中可能是重要的调控因子，对果实成熟的调控做了新的阐述。
研究思路
取材: 野生型番茄AC (Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig) 和 rin (cv. Ailsa Craig, backcross parent)（花后46天）的果实，两个生物学重复(每个样由同一中表型下的10个果混合而成)。
文库构建: 4个链特异性文库插入片段长度为250-500nt
测序策略：PE100, Illumina HiSeq 2000
信息分析：
研究结果
1.LncRNA鉴定
通过表达量、转录本长度、编码潜能3个方面对lncRNA进行筛选鉴定，共发现3679个lncRNA(3981个亚型)。而且它们不是根据染色体而分布，与编码蛋白基因相似，lncRNAs在异染色质的的分布低于常染色质(图1A)，表明lncRNAs与编码基因共有相似的转录本结构，此外，一些 lncRNAs 由基因座转录而来，比蛋白编码基因更接近于端粒(图1A)。将番茄lncRNAs分为4大类基因间、内含子、重叠、反义lncRNAs(图1B)。lncRNAs (85.1%) 位于基因间区 (图1B). 4种类型的lncRNAs的数量几乎相同(图1B)。与mRNA比较，lncRNA的外显子数目和转录本长度均低于mRNA。
图1. 3679个番茄 lncRNAs的分布于分类情况
2.lncRNAs的靶miRNAs预测
用psRNATarget和psRobot 检测所有的（3679个）lncRNAs，只鉴定出了三个靶标miRNA (图2A)，可能由于一些低表达的lncRNAs不能用测序技术检测出来。此外，只检测出3个eTMs（图2B）。
图2. lncRNAs的 miRNA靶标和内源性目标mimcs的预测
3.与成熟相关的lncRNA鉴定
在AC和rin中共表达的lncRNAs有3530个，只在AC中表达的有23个，只在rin中表达的有126个（图3A），总共有677个lncRNAs 在AC和 rin中的表达显著不同。与AC相比，这677个 lncRNAs有490个 在rin里上调，其余 187 个lncRNAs 下调。从这些差异表达lncRNAs中筛选出了10个与成熟相关的lncRNA，QRT-PCR进一步证明这10个lncRNA确实与成熟相关。用VIGS转染番茄沉默掉这些新的与成熟相关的基因间lncRNAs可以显著地延缓果实的成熟。
图3. lncRNAs在AC和rin果实中的差异表达