Radical remodeling of the Y chromosome in a recent radiation of malaria mosquitoes
疟蚊经过辐射后的Y染色体的重构
期刊：PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA (PNAS)
IF：9.423
年份：2016
【摘要】
在许多物种中，Y染色体都控制着雄性的基本功能特征，包括性别和生育。然而，由于Y染色体异染色质重复的抑制，使Y染色体的序列信息仅限制在少数的模式生物中，所以也限制了我们对于Y染色体在生命进化树的生物学意义的了解。文章对非洲最主要的疟蚊Anopheles gambiae进行长单分子测序，研究未发生重组的Y染色体的组成及结构。文章发现，An. Gambiae的Y染色体几乎完全由几个大量扩增、串联重复组成，还有一些可以与X染色体上相似的重复序列发生重组。经过辐射的种进行特异性别基因组测序，发现An. gambiae中序列发生迅速调整。对可以代表所有生长阶段的52个特异性别的An. gambiae的RNA-seq数据集进行分析，发现伴Y基因的一小部分缺少X同源的保留基因，但在其他除了An. gambiae的物种中是不伴Y的。所有种的Y染色体中，YG2是唯一的保守基因，但是在进化距离相对较远的蚊子基因组中，并没有发现与YG2相似的序列，表明这种传疟媒介中Y染色体基因进化速度很快。An. gambiae Y染色体的大量特征，为雄性蚊子的研究奠定了基础，对Y染色体的处理也有利于形成新的防蚊策略。
【研究思路】
取材：
样本来自An. gambiae的野生或者转基因G3种
文库构建：
基因组DNA库的构建使用了Pacific Biosciences recommended protocols和P4-C2 试剂
测序策略：
PacBio对基因组DNA进行三代测序
信息分析：
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【研究结果】
1、 An. gambiae Y染色体序列的分析
为了对可能的Y连锁基因进行断定，研究者建立了两个计算方法，挖掘来自特异性别DNA池的short-read (Illumina)基因组序列。一种是Y染色体基因扫描法(YGS)，另外一种是染色体商法(CQ)。CQ是根据序列与参考序列比对时的雌雄比例来推测是否Y染色体连锁，CQ法将未组装的reads分为一类，作为Y染色体序列数据库(Ydb)。图1显示，卫星AgY477是An. gambiae Y染色体的主要组成部分，并且有很强的雄性偏好性，在An. merus中也大量存在，但是并没有表现出强烈的性别偏好，而在An. arabiensis和An. quadriannulatus中并没有发现。结合这两种方法还发现8个基因(YG1-8)，其中有三个是以前已经发现的。在An. gambiae所有的Y连锁基因中，只有YG2是在其他三个相近种中都存在的（图1）。
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图1 不同种An. gambiae的Y染色体组成及表达模式 （最上面一行）黑箱子表示Y连锁，白箱子表示要么在不同种中完全缺失要么在它们的Y染色体中完全缺失，灰色箱子表示与Y连锁的未知状态。值得注意的是，灰色表示的序列的CQ或者RCQ的值大约为1，表明它们要么都在性染色体上，要么都在常染色体上。右侧是物种进化树，为Y染色体组成的变化提供了进化环境。在这4个种中，只有YG2基因是保守的。（中间一行）对特定性别的An. gambiae在不同生长阶段和不同组织（除胚胎）的转录本进行分析。（最下面一行）An. gambiae的Y染色体基因的组织结构。ara: An. arabiensis; Car：成年动物实体：Em：胚胎; gam: An. gambiae; L1–L3：第一到第三幼虫龄期; mer: An. merus; RT：成年生殖组织; stDNA：卫星 DNA; qua: An. quadriannulatus.
1、 An. gambiae的Y染色体包括大量扩增卫星和反转座子
图2A可以反映出Ydb中大约98%的碱基，数据显示NRY含有大量的同源的卫星DNA，Y染色体序列的主要特征，我们将之称作卫星扩增区域(SAR)（图2A）。图C显示不同的卫星DNA共同存在与相同的PacBio read中，这是由于姐妹染色单体或者染色单体内部发生交换而造成的。
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图2. An. gambiae的NRY（非重组的Y染色体）主要由一些卫星序列和转座子(TEs)的大量扩增串联序列构成。(A)An. gambiae Y染色体的两个主要部分(ZAR和SAR)，在Ydb序列中占到92.3%，Ydb反映出An. gambiae中NRY的含量。左图是ZAR的组织结构，包含了zanzibar的从头到尾的串联排列，偶尔会有其他转座子的插入。每个zanzibar单元的黑绿色的箭头（B为放大图）代表单个的LTR，打断zanzibar单元的线表示其他TEs的插入。BAC10L19中的星号表示非典型的zanzibar单元（可能是由于重组或者错误装配造成的）。右图是SAR的组织结构，显示出每个同源单体序列(Y73915, Y46532, Y55593)。(B)是单个zanzibar单元的示意图，由多个domain和单个LTR构成。(C)来自Ydb的PacBio reads中Y染色体基因的共存在的矩阵。这些结果表明，卫星序列共存在于SAR中，TEs共存在于ZAR中，但是ZAR和SAR缺失相互独立存在的。
3、对幼年种辐射后Y染色体的动态结构变化
经CQ推测出的Y连锁结构，在An. gambiae的样本中都很相似，但是伴Y序列相应的拷贝数却是不稳定的（图3）。雄性样本中的卫星序列AgY53D和AgY280显示出SAR或ZAR成分的拷贝数的变化（图3）。YG2基因是唯一的保守基因，但是，却不是单拷贝基因，可能是受到比对到YG2的reads数量的影响（图3）。
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图3 卫星AgY53D和AgY280显示出An. gambiae自然群体中雄性的大量的结构活性，用小提琴图来表示，其中，蓝色表示雄性，红色表示雌性；YG2表示预测的决定雄性性别的基因；white表示单个复制的伴X基因。与YG2和white相比，个体间reads比对到卫星单体的数量差距很大。
为了研究种间的Y染色体结构变化的程度，研究者利用特异性别池的Illumina序列(Anopheles arabiensis, Anopheles quadriannulatus和Anopheles merus三个种)做FISH（荧光原位杂交）（图4），同时还对雄性偏好性以及相对丰度进行评估。
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图4 物理图谱反应了An. gambiae及其他种的Y染色体序列的动态结构。在雄性An. gambiae Kisumu (zanzibar, YG5), An. gambiae Asembo (AgY53B), An.quadriannnulatus SANGWE, An. arabiensis Dongola, 和An. merus MAF种的染色体上做反转座子zanzibar, 卫星AgY53B, 和基因YG5 (绿色信号) FISH（荧光原位杂交）。除了zanzibar，所有试验都用到18S rDNA探针（红色信号），染色体用DAPI（蓝色）染色。
4、Anopheles属的XY染色体重组
对SAR的成分进行FISH（荧光原位杂交）映射（图4），或者通过显微剖析Y染色体荧光标记序列（图5A），都表明Y与X异染色质之间由于卫星单体的相似性而发生大量交叉重组。另外，文章还发现个别An. gambiae PacBio reads的重组印记（图5C），为之前的PCR扩增序列提供证据。
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图5 An. gambiae的X和Y染色体并不是基因隔离的。(A) An. gambiae Pimperena种的雄性幼虫染色体分裂前中期（左图）和中期（右图）图，染色体使用YOYO-1（绿色）染色。(B)小提琴图显示的是来自An. gambiae 的40个雄性个体（蓝色）和45个雌性个体（粉色）的标准化后的reads比对到卫星AgY477, AgY373, AgY53A和AgY53B单体上的数量，并与比对到white gene (伴X单拷贝) 和 zanzibar（Y偏好）的数量进行比较。(C)两个PacBio reads的例子(pacbio_7224704_1和pacbio_5551309_1), 主要的伴X卫星(AgY367红色表示)和伴Y卫星(AgY373, 蓝色表示; AgY477, 黄色表示)都在图中表示出来。黑色箭头表示伴X和伴Y卫星的连接，紫色和橙色分别表示AgX367-AgY373以及AgX367-AgY477的重组，绿色盒子表示AgY477-AgY373的重组。
【研究结论】
1、 文章结合三代测序技术对对非洲最主要的疟蚊Anopheles gambiae进行长单分子测序，研究未发生重组的Y染色体的组成及结构。
2、 文章发现，An. Gambiae的Y染色体几乎完全由几个大量扩增、串联重复组成，还有一些可以与X染色体上相似的重复序列发生重组。
3、 对可以代表所有生长阶段的52个特异性别的An. gambiae的RNA-seq数据集进行分析，发现伴Y基因的一小部分缺少X同源的保留基因，但在其他除了An. gambiae的物种中是不伴Y的。
4、 An. gambiae Y染色体的大量特征，为雄性蚊子的研究奠定了基础，对Y染色体的处理也有利于形成新的防蚊策略。
【所用到的软件或数据库】
PacBio：是目前测序长度最长的测序方法，平均读长达到8kb。
RNA-STAR：对RNA序列进行快速全局比对，STAR, 很犀利, ENCODE专属RNA-seq工具. 在准度和时间消耗上, 效果拔群。
HTseq-count：是一款用于reads计数的轻便软件，可以用于多种mapping软件的输出结果。
ZenLite：一款成像软件，文中用来预测Y染色体大小。
Bowtie：Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。Bowtie并不是一个简单的拼接工具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。模板最小尺寸不能小于1024碱基，而短序列最长而不能超过1024碱基。换言之，bowtie非常适合下一代测序技术；
Clustal Omega：在线比对工具。
PhyML：构建ML系统发育树的软件。