Structural and Functional Analysis of the GRAS Gene Family in Grapevine Indicates a Role of GRAS Proteins in the Control of Development and Stress Responses

期刊：FRONTIERS IN PLANT SCIENCE

IF：4.495

年份：2016

【摘要】

GRAS转录因子参与植物生长发育的很多过程，还参与很多植物抗病以及非生物胁迫反应过程，但是在葡萄科中这类基因的研究却甚少。文章从最近上传的基因组中提取GRAS基因，构建基因模型并逐步改进，发现三个新的葡萄/木本植物特定基因。系统发育分析显示，GRAS基因被分为13个组，且被映射到19 V. vinifera染色体上。同时，还发现5个亚科，之前在其他种中并没有发现过。文章又通过多序列比对发现了典型的GRAS结构域并且还发现一个新的motif. 此外，对其他种的研究发现，无论是间断还是连续重复都会显著影响葡萄科GRAS基因的进化。不同组织在生物或非生物胁迫下的基因表达模式中，GRAS基因可能发挥不同的功能。通过对西红柿科和葡萄科的比较，在跃变期和非跃变期果实催熟过程中，发现一些保守转录因子的候选基因。总之，文章旨在提高多肉水果的质量，为进一步的功能分析提供相关候选基因等可靠信息。

【研究思路】

取材：基因序列来自之前报道过的GRAS蛋白编码基因、参考基因组来自URGI数据库、非冗余基因记忆COST注释基因来自ORCAE数据库、拟南芥GRAS蛋白序列信息从TAIR数据库获得、256个来自不同条件的基因表达数据来自三个不同的芯片平台（见测序策略）、其他16种植物的GRAS基因序列来自PlantTFDB数据库

文库构建：

测序策略：基因表达数据来自以下芯片平台：GrapeGen (21k probesets), Vitis Nimblegen array (29k probesets)以及内部的RNA-seq项目

信息分析：

【研究结果】

1、系统发育分析

通过构建的系统发育树，发现了13个葡萄科的亚科，其中8个是已经发现的，另外5个是新发现的（图1）。有趣的是，有研究报道，西红柿科也有相同的13个亚科。文章还根据与拟南芥的同源关系以及基因特征对新发现的5个亚科进行定义。

图1 葡萄和拟南芥GRAS基因的系统发育分析。葡萄科中发现13个亚科：已经发现的DELLA, HAM, LISCL, PAT, LS, SCR, SHR, 和SCL3，还有新发现的5个亚科GRAS8, GRASV1, GRASV2, GRASV3, and SCL26.

2、GRAS蛋白结构及亚科特异motif

在GRAS蛋白C末端发现5个特征保守motif，分别是LHRI, VHIID, LHRII, PFYRE, SAW（图2）。图2还显示出不同的亚科所具有的特征motif以及保守motif：比如LHRI分为A和B两个单元，亮氨酸在A单元中反复重复出现；B单元包含一个核酸定位信号(NLS).

图2 GRAS蛋白结构和亚科特异motif. 上图显示5个保守motifs：LHR I, VHIID, LHR II, PFYRE, and SAW.亚科特异motif用罗马数字表示，GRASV1 (SCR-like) 没有结构域V. GRAS8 (SCL3-like)没有结构域VIII.GRASV2, V3, 和SCL26 (HAM-like) 没有结构域XIII, XIV, 以及XV. HAM和HAM-like没有NLS.

3、葡萄科GRAS基因与其他测序植物基因组的同源性分析

对V. vinifera葡萄科与其他物种的GRAS基因做同源性分析（图3），同源关系被分为三类：(i)出现在葡萄科但是不在其他物种中的基因；(ii)葡萄科基因与所给物种基因表现出一对一关系；(iii)葡萄科基因与给定物种存在同源性，但是没有明确的同源基因。图3反映出一些可能存在进化保守功能的基因，比如VviPAT1,VviSHR1,VviSCR1, and VviSCL26g，因为这些同源基因存在于给定的所有物种中。

图3 葡萄科GRAS基因与其他测序植物基因组的同源性分析。绿色表示物种之间一对一的同源基因（最佳匹配）；灰色表示葡萄蛋白和其他物种之间存在同源性，但是并没有检测到一对一的同源基因（不是最佳匹配）；白色表示没有匹配。

4、GRAS基因在染色体上的定位

葡萄科基因组GRAS基因不均匀地分布在19条染色体上，crh 6和13染色体上GRAS基因数量最多，分别含有6和7个基因。同一组但分布在不同的染色体上的GRAS基因可能是由于祖先多倍体化产生了旁系同源片段。

图4 葡萄科GRAS基因在染色体上的定位。其中，用相同颜色联系起来的不同染色体代表的是旁系同源区域。

5、葡萄科GRAS基因表达分析

基于公共数据库的表达数据的绝对值构建GRAS基因表达图谱，结果通过图5展现出来，发现VviPAT基因在所有的组织中都有表达，包括其他种。不同亚科的基因表达也不相同：对于SHR亚科，VviSHR1, VviSHR2和VviSHR3基因往往倾向于在除了花的器官和花粉粒以外的其他组织中；LISCL亚科的成员则表现出不同的表达模式，VviLISCL3, VviLISCL5, VviLISCL8和VviLISCL12在除了花粉粒以外的所有组织中表达，但是VviLISCL2, VviLISCL7, VviLISCL10几乎在所有组织中都不表达。VviRGA3, VviRGA4, 和VviRGA5基因在所有组织中都表达。VviSCR3在花粉粒、成熟果实以及衰老叶片中表现出表达高峰；还有三个SCL3基因表现出相似的表达模式。

图5 葡萄不同组织中GRAS基因的表达。渐变的颜色表示经RMA标准化以后的表达强度值

6、葡萄生长成熟过程中、面对非生物胁迫，GRAS基因的表达

文章利用公共表达数据挖掘GRAS基因在果实成熟的过程中的特征。其中，VViPAT3, VviPAT4, VViPAT6序列相似度很高，由于受到成熟过程的影响，他们在开始成熟的时候表达量很低，而在过度成熟的时候表达量很高。文章发现另外一个有趣的现象，在Trincadeira和Corvina中，与AtSCL23直系同源的VviSCR2基因在成熟过程中表达下调（图6）。

图6 葡萄生长成熟期GRAS基因的表达。左侧表示用GeneChip基因芯片实验；中间表示用Grapegen基因芯片实验；右侧表示用Nimblegen基因芯片实验。

除此之外，文章还对非生物胁迫和生物胁迫下，GRAS基因的表达作了分析（图7、8）。

图7 非生物胁迫环境下，GRAS基因的表达。左侧表示用GeneChip基因芯片实验；中间表示用Grapegen基因芯片实验；右侧表示用Nimblegen基因芯片实验。

图8 生物胁迫环境下，GRAS基因的表达。左侧表示用GeneChip基因芯片实验；中间表示用Grapegen基因芯片实验；右侧表示用Nimblegen基因芯片实验。

【研究结论】

1、文章对葡萄科GRAS基因进行了详细的分析，包括(i)染色体定位；(ii)基因结构分析；(iii)与其他物种的系统发育及基因表达分析

2、文章通过系统发育分析，发现GRAS基因被分为13个组，且被映射到19 V. vinifera染色体上。同时，还发现5个亚科，之前在其他种中并没有发现过。

3、此外，对其他种的研究发现，无论是间断还是连续重复都会显著影响葡萄科GRAS基因的进化。不同组织在生物或非生物胁迫下的基因表达模式中，GRAS基因可能发挥不同的功能。

4、通过对西红柿科和葡萄科的比较，在跃变期和非跃变期果实催熟过程中，发现一些保守转录因子的候选基因。

【所用软件及数据库】

☆URGI数据库：预测植物或真菌的蛋白簇数据库( https://urgi.versailles.inra.fr/ ).

☆ORCAE数据库：提供在线的基因注释资源( http://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/ ).

☆UGene软件：用来构建基因模型，测试并修正基因结构。

☆IGV软件：是一种探索大型综合基因组数据的高性能交互式可视化工具。

☆TAIR数据库：拟南芥数据库( https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/GRAS.jsp ).

☆MUSCLE软件：用于多序列比对的软件。

☆MEGA6软件：用于构建进化树。

☆PlantTFDB数据库：植物转录因子数据库。