【文章题目】

苏云金杆菌(B. thuringiensis)在克服抗虫性过程中的持续进化

Continuous evolution of B. thuringiensis toxins overcomes insect resistance

【基本信息】

期刊：NATURE

IF：38.138

年份：2016

【摘要】

苏云金杆菌的内毒素δ-endotoxins(Bt toxins)作为杀虫蛋白被广泛应用于改造作物的工作中，为农业、经济和环境提供巨大效益。然而，昆虫对于Bt内毒素的抗性的进化发育限制了它的有效期。本研究建立了一种噬菌体辅助连续进化(PACE)选择的方法，提高蛋白与蛋白之间相互作用的亲和力，并用来进化Bt内毒素Cry1Ac的变异体，从而提高与害虫尺蠖(TnCAD)的类钙粘蛋白受体结合活性。结果表明，进化的Cry1Ac变异体与TnCAD的亲和力高达Kd = 11–41 nM，有效杀死有TnCAD表达的昆虫细胞，相比野生型Cry1Ac而言，Cry1Ac变异体对昆虫杀伤力高达335倍。本研究建立了与新型昆虫细胞受体结合的Bt内毒素的进化，有利于克服昆虫对于Bt内毒素产生的抗性，同时，也为野生型Bt内毒素对昆虫产生杀伤力而提供有效途径。

【研究思路】

测序策略：

本研究既使用了短读段的Illumina测序，又使用了长读段的Pacific Biosciences测序

信息分析：

【研究结果】

1、 蛋白结合PACE的研究进展

PACE（噬菌体辅助连续进化）可以加快不同蛋白的演化，但是PACE并未用来演化蛋白质结合活性，研究人员推测，细菌-2-混合系统可以作为研究蛋白质结合活性PACE筛选的基础（图1a），靶结合定位于受体基因RNA聚合酶上游，引起基因表达。为了适应PACE过程中蛋白结合的选择，研究人员预想：蛋白靶结合可以代替激活噬菌体基因III的表达，需要的是子代噬菌体的感染性（图1b）. 为了提高细菌-2-混合系统的灵敏度，研究者还对相关参数做了一些优化。

图1 结合蛋白的噬菌体辅助连续进化(PACE)  a. PACE过程中，噬菌体感染宿主细胞的分解示意图，宿主细胞E.coli携带有两个质粒：辅助质粒(AP)将结合蛋白与噬菌体的繁殖联系在一起控制选择作用；另外一种是突变质粒(MP)，在PACE过程中能够由阿拉伯糖诱导突变。b. 感染发生后，受选择的噬菌体(SP)编码的进化蛋白与靶蛋白结合诱导AP的基因III的表达，噬菌体蛋白需要子代噬菌体来感染子代的宿主细胞。PACE发生在固定的容器内，需要用新鲜的宿主细胞不断稀释。

为了对蛋白结合PACE进行验证，研究者利用该系统演化HA4Y87A 突变体的SH2结合单体，图2表明蛋白结合PACE可以加速演化蛋白与靶蛋白之间的亲和性，但需要进行多种突变提高蛋白结合活性。

图2 结合蛋白PACE选择及调节过程  a. 通过荧光素酶的表达测定靶蛋白与转录输出之间的关系。ABL1 SH2结构域与HA4单体结合的数量受到434cI DNA结合结构域的不同价态(1x, 2x, 4x, or 6x SH2)的调节；“No operator”表示434cI操纵子控制AP; b. PACE过程中，无活性的单体突变型HA4Y87A在MP无诱导时不发生突变，在阿拉伯糖诱导下突变增强，在有基因漂变发生时突变也增强，随后经过选择与ABL1 SH2靶蛋白结合；c. 基因漂变与增强突变相结合（绿色）导致在87位的Tyr和Trp发生进化，恢复SH2结合活性，没有突变发生（红色）或者没有基因漂变的突变（蓝色）导致噬菌体被淘汰。

2、Cry1Ac与TnCAD的结合力

Bt内毒素与昆虫肠道细胞蛋白受体的结合在杀虫活性的机制中至关重要，为了克服昆虫对Bt内毒素产生的抗性，本研究试图演化Cry1Ac（使用最广泛的Bt内毒素）与TnCAD（昆虫细胞膜钙粘蛋白受体）的结合力。研究者对Cry1Ac的四个片段进行528小时的PACE演化，得到不同的突变体（图3a），图3c表明Cry1Ac突变体的第四个片段的末端可以激活转录，提高与TnCAD-F3结合活性。

图3对Cry1Ac突变体的四个片段以及与TnCAD钙粘蛋白受体亲和性的连续演化  a. 对四个片段的PACE演化研究，图中显示的是噬菌体效价（彩色线条）和湖流量（灰色线条，PACE发生的固定容器称作“lagoon”）在所有样本不同时间点的变化，图中可以表明利用宿主细胞培养的噬菌体的连续演化过程；b和c分别表示利用434cI-TnTBR3-F3 (b)和434cI-TnCAD-F3(c)进行的转录活性测定，以及PACE过程中单个RpoZ-Cry1Ac突变体的演化；d. PACE过程中，根据高通量DNA测序数据进行核苷酸亚型分析，核苷酸亚型包含的高频突变体(≥ 1%)勇不同的多边形表示，不同的颜色表示在Cry1Ac演化过程中的不同阶段，表中显示的是每个核苷酸亚型的突变体。e. PACE实验的演化轨迹表明PACE过程中的重组实例以及突变速率、选择和靶蛋白在演化中的影响，颜色与数字d中相对应。

3、演化过程中的Cry1Ac突变体的特点

为了说明TnCAD-F3结合活性的进化轨迹，研究者对所有样本进行高通量DNA测序（既使用了短读段的Illumina测序，又使用了长读段的Pacific Biosciences测序）。根据之前的突变分析，研究者设计并合成了一致的Cry1Ac突变体，包括了所有最常见的突变体（图4a. b）；Cry1Ac在昆虫肠道被酶解激活，但是，野生型Cry1Ac被分割成不同的活化型，演化一致的突变体通过胰蛋白酶表现出很强的蛋白酶解作用（图4c）；图4d显示，胰蛋白酶激活的一致突变体对Sf9细胞造成很大的杀伤力，而野生型Cry1Ac则不产生任何毒性。

图4演化过程中的Cry1Ac突变体的特点  a. 演化过程中的Cry1Ac突变体的序列特征，包括D384Y/S404C双突变(DM)，可以识别TnTBR3-F3；b. 根据胰蛋白酶水解作用，对Cry1Ac突变体的SDS-PAGE分析，可以看出不同突变体蛋白水解作用的不稳定性S=溶解的原Bt内毒素晶体，T=胰蛋白酶处理；c. Sf9细胞中的毒性试验，黑色表示ABCC2受体，绿色表示TnCAD受体。Cry1Ac改变细胞通透性导致荧光染料进入细胞，所以荧光性增强。演化的Cry1Ac突变体诱导细胞表达TnCAD，野生型Cry1Ac则没有这样的功能；d. 对野生型和Cry1Ac突变体的昆虫幼虫食性的生物鉴定结果表明，在昆虫幼虫中，由于破坏了稳定性二导致演化的Cry1Ac突变体的效价丧失。

4、演化的Cry1Ac突变体在体内的活性

最后，研究者测定了稳定演化的Cry1Ac突变体在幼虫体内的杀虫活性，与体外实验结果一致，稳定演化的Cry1Ac突变体相对于稳定演化之前的突变体表现出相当大的杀虫活性。以上结果可以证实，通过对Bt内毒素蛋白受体的演化，可以有效克服害虫对Bt呢毒素产生的抗性。

图5 稳定演化的Cry1Ac突变体能够有效增强亲和活性  a. 由PACE演化的稳定及不稳定的突变体的序列、耐热性以及与TnCAD的结合活性； b. 对胰蛋白酶消化反应的SDS-PAGE分析表明D384Y和S404C回复突变的稳定性显著提高S=溶解的原Bt内毒素晶体，T=胰蛋白酶处理；c. 使用Sf9细胞作毒性试验， ABCC2（黑色）受体或者TnCAD受体（绿色）过表达，演示ABCC2或者TnCAD与稳定突变体之间的活性的变化；d. e. 将高度纯化的野生型Cry1Ac，演化一致的突变体或者稳定演化的突变体添加到易感Cry1Ac(d)或者抗Cry1Ac(e)的幼虫培养基中，相比野生型Cry1Ac，稳定演化的Cry1Ac显著提高了易感Cry1Ac幼虫的致死率；在抗Bt内毒素的T. ni幼虫中，稳定演化的突变体对幼虫的致死率也显著高于野生型Cry1Ac.

【研究结论】

1、 本研究建立了一种噬菌体辅助连续进化(PACE)选择的方法，可以提高蛋白与蛋白之间相互作用的亲和力，并用来进化Bt内毒素Cry1Ac的变异体，从而提高与害虫尺蠖(TnCAD)的类钙粘蛋白受体结合活性。

2、 结果表明，进化的Cry1Ac变异体与TnCAD的亲和力高达Kd = 11–41 nM，有效杀死有TnCAD表达的昆虫细胞，相比野生型Cry1Ac而言，Cry1Ac变异体对昆虫杀伤力高达335倍。

3、 本研究为防止昆虫对Bt内毒素产生抗性提供有效方法，同时也为与蛋白结合的大分子的快速进化提供研究平台。

【所用软件及数据库】

bowtie v2.1.0：用来map DNA测序的工具，它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。换言之，bowtie非常适合下一代测序技术。

samtools v0.1.19：是一个用于操作sam和bam文件的工具合集。