1、 为何完成图选择三代测序平台？

受测序片段长度的限制，细菌基因组序列通常需要利用软件算法将大量测序片段拼接起来，而细菌基因组中重复序列的存在，则会大大增加拼接的复杂度。细菌重复序列的大小从几百bp到7 Kb不等，细菌框架图的插入片段，只能解决少量的重复片段问题，因此组装结果更加碎片化；细菌精细图采用了6 Kb大片段文库，可以跨过绝大部分重复序列，并将结果Scaffold控制在30条以内；而三代测序采用了10 Kb文库，平均读长也达到10 Kb以上，由于序列够长，避免了细菌基因组中重复序列的影响，因此能够获得0 gap的完整组装结果。

2、 对于细菌基因组测序，三代和二代测序相比有何优势？

三代测序的优势在于读长长，准确度高，GC含量影响小，而劣势是测序成本偏高。对于细菌基因组测序来说，三代测序的读长长可以解决细菌中的重复序列问题，也避免了异常GC菌株的测序不均匀问题。由于细菌基因组较小，需要的测序量不大，对于较为精细的细菌完成图来说，三代成本甚至低于二代结合一代的策略。随着三代测序通量提升和成本降低，未来三代测序有望在细菌基因组领域获得更广泛的应用。

3、 群体进化分析，对于参考基因组选择有什么要求？

研究多个菌株之间的起源关系和进化顺序，可以选择这些菌株之间的单拷贝核心基因作为遗传标记，构建物种进化关系，以此为基础进行分歧时间、地域传播、选择压力等相关研究。一般来说，选择的基因组间亲缘关系越远，单拷贝核心基因的数目也就越少。如果单拷贝核心基因的数目低于一定限度，如数百个基因以下，则进化树的精度会受到影响。以典型的应用场合为例，可以选择5株左右同一属的菌株，再额外选择2株左右临近属的菌株作为外群，总共5~8株菌株用于构建进化树。

4、 基于共线性分析检测得到菌株变异，应该如何解读？

基于共线性分析检测，可以得到目标菌株不同类型的变异，一般按照变异对蛋白序列的影响严重程度，优先关注影响较大的基因。一般可参考如下顺序：基因插入缺失>导致移码突变的InDel>非移码InDel≈非同义SNP>同义SNP。其中基因插入缺失，特别是新基因的插入，通过重测序手段往往难以检测到。这也是为什么我们更推荐基于组装结合比较基因组手段检测变异的原因之一。