Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. Nature Communications (2016.07) IF = 11.329
玉米（Zea mays）是全球重要的农作物，也是研究植物转录组代谢通路的遗传模型。玉米基因组序列于2009年公布，后续利用EST和RNA-Seq转录组数据对其基因注释进行了补充。然而RNA-Seq中，短读长无法提供转录本全长序列，限制了可变剪接形式的鉴定，同时，短读长拼接会得到错误的转录本。
近期，来自冷泉港实验室等单位利用PacBio长读长测序技术，对玉米6个组织进行了全长转录组测序分析，在已有的玉米B73 RefGen_v3上发现了大量新信息，揭示了玉米基因表达的复杂性。
研究材料： 取玉米自交系B73不同发育阶段的6个组织（根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗），提取mRNA, 反转录过程中加组织特异性barcodes，按照等摩尔比值cDNA平均混合。
建库测序：构建6种插入片段文库（<1,1–2, 2–3, 3–5, 4–6 和>5 kb)后，加上序列特异性的barcode，上机46个SMRT Cell进行全长转录组测序。对6个组织进行二代RNA-Seq测序，每个样品三个重复。
研究方法：通过已发表的甲基化数据，对isoform，lncRNA 和 non-lncRNA区域进行甲基化分析。
研究结果：
1.下机得到了3,716,604条reads，过滤得到接近一半的全长转录本序列（1,553,692，42%）。ToFu处理得到643,330个高质量的转录本序列，其中606,145个序列（94.2%）能够比对到玉米RefGen_v3参考基因组上。
2.经聚类分析得到了111,151个isoform，对应26,943个基因，涵盖了玉米RefGen_v3基因注释的70%。其中57% isoform来自已知基因位点的新isoform；2,803个 (3%) 新isoform来自2,253个新位点（Fig. 1）。
Fig. 1 PacBio 和RefGen_v3的isoform比较
3.在不同生长发育阶段的6个组织中，花粉具有最多的组织特异性isoform（9,842，61.3%），其次是胚芽（20,050，49.2%），再次是胚乳（12,392，46.7%），根的isoform最少(13,386，44.6%) (Fig. 2)。GO 分析表明，这些组织特异性isoform，通常与组织特定的分子功能相关。
Fig. 2 6种不同组织的所有PacBio Isoform
4. 玉米RefGen_v3中，已注释了来自57个家族的2,624个转录因子。在PacBio Isoform中发现了来自53个家族的新isoform，转录因子数量增至5,423个。其中155个新isoform与这些生长激素应答的功能相关。
5. 已有研究中有1,704个高度可信的LncRNA（平均长度为463bp）。本次分析得到了878个LncRNA，其中11个是已有研究确定的， 另外867个是新发现的LncRNA（平均读长为1.1kb）(Fig. 3)。
Fig. 3 本次分析确定的新与已确定的lncRNAs 长度对比
6. 将PacBio isoforms与 Illumina短读长组装的isoform分析结果进行了比较，其中短读长数据运用两种分析方法（Cufflinks和Trinity）进行对isoform进行组装，能鉴定到PacBio的isoform分别仅为22%和8%，表明转录组短读长分析方法在检测isoform的局限性，而PacBio长读长能得到精确的isoform，尤其是在一个基因对应几种isoform的复杂情况下优势明显。
Fig 4. PacBio的isoform对短读长组装构建的isoform评估
7. CHG甲基化主要富集在acceptor位点，CG甲基化主要富集在donor位点， donor位点的CG甲基化能够促进可变剪接，CHH甲基化与可变剪接病没有显著的相关性。同时，发现non-lncRNA genes具有相对较高的CG甲基化水平，而lncRNAs具有相对较高的CHG甲基化水平，这些甲基化水平可能与基因的不同表达水平有关。
PacBio 超长读长无需组装即可得到全长转录组信息，直接获得了isoform信息，解密玉米转录组复杂的基因表达信息。
参考文献
Bo Wang et al., (2016). Unveiling the complexity of the maize transcriptome bysingle-molecule long-read sequencing. NATURECOMMUNICATIONS.