Genome-wide identification of Wig-1 mRNA targets by RIP-Seq analysis
Oncotarget , IF=6.359, 2015.11
利用RIP-seq 技术在全基因组水平分析RNA结合蛋白Wig-1的靶RNA
研究背景：Wig-1属于RNA结合蛋白，可以增加肿瘤抑制因子p53和原癌基因N-Myc 的mRNA的稳定性并降低促凋亡fas受体的mRNA的稳定性(导致细胞死亡率降低)。但对Wig-1靶RNA以及结合motifs的序列和结构信息研究的较少。本研究利用RIP-Seq技术，在两种细胞系中进行了Wig- 1靶RNA的进一步研究。
研究材料：HCT116 cells
① 表达 Flag-tagged Wig-1 (W)
② 表达 Flag-tagged空载体(control )
Saos-2 cells
① 表达 Flag-tagged Wig-1 (W)
② 表达 Flag-tagged空载体(control )
③ 表达点突变的Flag-tagged Wig-1(突变后不能结合RNA)(Wmut)
（Flag-tagged Wig-1：带有flag标签的Wig-1，可利用flag标签制备特异抗体）
测序策略：Illumina HiSeq 2000，PE (2x100bp)文库
研究结果：
通过RIP-seq 鉴定RNA结合蛋白Wig-1的靶mRNAs
1) 测序数据量
在HCT116 细胞中表达Wig-1的样本(W)的测序reads为15.8 M；control组(表达空载体)为15.4 M ；而在 HCT116 细胞中，具体情况为：W组17.3 M；control组20.6 M；Wmut 组21.2 M
2) Mapping率
各样本获得数据与基因组进行mapping。结果发现：表达Wig-1的样本比表达空载体的样本mapping率高，在 HCT116细胞中高出14%，在Saos-2 中高出16%；另外，表达Wig-1的Saos-2细胞样本比表达点突变Wig-1 的mapping率高出20%。
3) 富集分析
富集分析结果表明，在HCT116和Saos-2细胞中分别获得了2335和354靶RNA，其中两者共有的靶RNA为286。研究还发现，Wig-1-RNA复合物分布在所有表达的基因范围内，说明Wig-1与靶RNA的结合与靶mRNA的表达水平没有相关性。
![RIP-seq]( "RIP-seq")
4）RNA-seq 和 RIP-seq 关联分析
该次RIP-seq分析与前期芯片检测敲除Wig-1的样本HCT116 进行关联分析发现：RIP-seq获得的靶mRNA中有209个受Wig-1敲除的影响。其中25 (12%) 个表达下调，184 (88%)个表达上调，说明Wig-1的首要角色是降低RNA结合蛋白的稳定性。
Wig-1靶RNA的功能分析 (GO和KEGG网络分析，DAVID 软件)
对在两细胞鉴定的286个共有靶RNA进行功能分析，其中有261个获得了GO功能注释，且KEGG富集分析发现，高达300条pathway存在显著富集(FDR < 0.01)现象。下表中前5位都是与细胞周期调控有关的。
RNA结合蛋白Wig-1的motif分析
前期研究表明Wig-1与其靶 mRNAs的结合是由位于转录本 3′UTR区的ARE motifs调控的。
本研究利用RSAT tool对筛选的286个靶mRNAs的ARE motifs进行分析，研究结果表明：与阴性对照样本(Wig-1 RIP后存在但未富集的mRNAs，称为unbound)中的286 mRNAs相比，bound组中87%的靶mRNAs含有典型的五聚体(AUUUA)，而unbound组中为 54% ，另外，bound 组中8% 的靶mRNAs含有2个连续五聚物(AUUUAUUUA)，而unbound组中为3%。综上说明，ARE motifs在本实验筛选的Wig-1靶mRNAs的3’UTR区显著富集，这与前期研究结果一致。
![RIP-seq]( "RIP-seq")