Illumina测序仪原理

Illumina新一代测序技术可以高通量、并行对核酸片段进行深度测序，测序的技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头构建文库，文库加载到测序芯片Flowcell上，文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序反应，即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。

       利用该技术，可以对任何物种（包括动物、植物、细菌、病毒、寄生虫等）在DNA水平上进行全基因组测序、基因组靶向区域测序，检测基因组范围内的遗传变异或多态性，在细菌、病毒等病原溯源上分辨率最高；在RNA水平上进行基因的表达测序分析，准确检测基因表达量和表达片段的序列信息；对DNA处理后，可以对基因组甲基化水平进行检测，从表观遗传学角度对影响基因表达的因素进行分析；利用转录因子的抗体对DNA进行处理，寻找转录因子影响的DNA序列信息，定位影响基因表达的片段；自然界存在的微生物基本上都是混合物，传统的Sanger法测序技术无法对混合物中的各微生物进行准确检测，利用新一代测序的高通量、并行性特点，通过宏基因组分析方法，可以从整体上对自然界本来状态进行分析，得到最客观信息。 

Hiseq 2500系统

HiSeq 2500系统是Illumina第一台特有两种运行模式的测序系统，包括快速和高通量两种模式，可使用一个或两个flowcells，具有很强的灵活和可扩展性。使用HiSeq v2试剂进行快速运行模式，可将读长提高到2x250 bp，快速模式提供更加快速的结果、数量有限样品的高效处理，以及更长的末端配对读取，这带来了更深度的覆盖，并改善de novo应用的组装。

高通量模式特别适合样品量较多的大型研究，或需要最深度覆盖的应用。HiSeq v4试剂凭借Illumina测序技术上的创新，提供了更高的簇密度和通量，同时增强了HiSeq平台的整体实用性。这些试剂盒中包含了立即可上样的试剂，是专为现有的HiSeq测序平台而设计的。。HiSeq 2500每次运行能产生40亿个reads和1 Tb的数据总输出量。每个流动槽500 Gb，运行周期为6天。这样，每天产生的数据量达167 Gb。

 HiSeq 3000/HiSeq 4000测序系统

 HiSeq 3000/HiSeq 4000测序系统是illumina公司于2015年1月新推出的两款测序系统。HiSeq 3000和4000系统是基于HiSeq 2500系统，并利用了为HiSeq X Ten系统而开发的patterned流动槽技术。其中hiseq3000采用单流动槽，Hiseq4000采用双流动槽。HiSeq 4000系统提供了最高的通量和每个样品的最低价格，适合广泛的应用。而单流动槽的HiSeq 3000系统则享有同样的低价格和快速运行时间。HiSeq 4000的能够在3.5天内测序12个基因组、100个转录组或180个外显子组；同时读长更长，2×150bp的超长读长，能获得更佳的序列拼接效果；HiSeq 3000通量为HiSeq 4000的一半。

PacBio RS II测序仪

PacBio RS测序仪是美国Pacific Biosciences 公司在2011年正式发售的第三代测序系统。并于2013年4月推出了新版本PacBio RS II。该款的单分子实时（SMRT）DNA测序系统能带来行业最高的一致准确性和最长的读长，且通量较之前的版本增加一倍。 

基于革命性的SMRT测序技术，PacBio RS II的平均读长达5,000 bp，最长读长超过20,000 bp。此系统提供了简单快速、端对端的SMRT测序流程，适合传染病、微生物、农业和复杂遗传病的研究。它让科学家能够快速经济地完成基因组组装、揭示并了解表观基因组，以及鉴定基因组变异。

PacBio RS II，可同时观察的测序反应数量增加一倍，这有效提高了系统通量。读取数量的增加将推动新的应用，如全长cDNA分析和全长16S宏基因组学。PacBio RS II特有PacBio的C2和XL试剂，自动de novo组装的新型分析软件。一致准确性提高到>99.999%（Q50），平均读长增加4倍，以及DNA起始量降低10倍。

三代测序特点：

读长长（平均10-15 Kb）

准确度高（30×精度达到99.999%）

无需PCR，无测序偏好性（包括高GC区）

实时测定表观遗传修饰（甲基化等）

三代测序应用方向：全长转录组测序、基因组Denovo测序，泛基因组测序、16S全长扩增等方向。